Les techniques conventionnelles en routine trop longues ont conduit au développement de techniques de PCR afin de détecter directement un fragment du génome de B. pertussis à partir des SNP.
Comme pour toute technique de biologie moléculaire, elle nécessite un laboratoire spécialisé.
Plusieurs types de technologies de PCR ont été mis au point pour détecter directement l'ADN de B. pertussis à partir des SNP, la technologie de PCR conventionnelle, comportant les trois étapes (extraction de l'ADN bactérien, amplification et révélation du produit amplifi é) et plus récemment la technologie de PCR en temps réel en cours de développement. La PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d'un reporter fluorescent dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés pendant la réaction de PCR sans nécessité de l'étape de postamplification (12).
Quatre régions du génome de B. pertussis ont été utilisées pour l'amplifi cation : la région promotrice du gène de structure de la toxine de pertussis (13, 14), la région située en amont des gènes de structure des porines (15), des séquences d'insertion répétées (IS481) (16, 17) et le gène codant pour l'adenylate cyclase (18). Les trois premières régions sont spécifi ques de B. pertussis, la quatrième ne permet pas de diff érencier les diff érentes espèces de Bordetella. La séquence d'insertion (IS481) présente en plusieurs copies dans le chromosome de B. pertussis (80 à 100 copies), apparaît comme une cible de choix pour l'amplifi cation en augmentant la sensibilité de la détection. Cependant des homologies de séquences sont observées avec une autre borde- telle (Bordetella holmesii) au niveau de la séquence d'insertion IS481, pouvant donner des fausses réactions positives (19, 20).
Théoriquement dans les techniques de PCR conventionnelle, il existe une relation quantitative entre la quantité de la séquence cible de départ et la quantité du produit amplifi é à n'importe quel cycle. En pratique, il n'est pas rare que les réactions de PCR en répliqua donnent des résultats diff érents.
Le développement de la PCR quantitative en temps réel a éliminé les variabilités traditionnelles associées à la PCR quantitative et permet une quantification fiable et routinière. Cette technique peut aussi estimer la concentration de la cible amplifi ée d'ADN par rapport à un standard et ainsi quantifier la charge bactérienne. Elle fait donc un suivi de la fluorescence émise pendant la réaction de PCR avec un indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle. Cette technique permet le suivi en temps réel de la réaction par le signal émis grâce à l'incorporation d'un marqueur fluorescent aux doubles brins d'ADN (SYBR® Green I) ou par